A partir de 1494, la jurisdicción en la que el tribunal desarrolla sus funciones son los territorios de la Corona de Castilla al norte del río Tajo. En el siglo XVI, este espacio geográfico era el territorio más próspero de la Corona de Castilla, poblado por más de 4 millones de habitantes y con ciudades de la importancia de Toledo, Segovia o Burgos. Todo ello conduce a que la Real Audiencia y Chancillería de Valladolid sea el tribunal más activo e influyente del reino.
Este ámbito jurisdiccional se corresponde en la actualidad con las comunidades autónomas de Galicia, Principado de Asturias, Cantabria, País Vasco, La Rioja, Castilla y León, Comunidad de Madrid, Extremadura y Castilla-La Mancha. Los documentos gráficos conservados en el Archivo permiten hacer un interesante recorrido visual por estas nueve regiones.
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