Alla vigilia della sua morte e a causa all'aggravamento della malattia che lo affliggeva, Ferdinando II d'Aragona fece testamento a Madrigalejo, dinanzi al protonotaio Miguel Velázquez Climente. Revocando qualsiasi ultima volontà precedentemente espressa nei due testamenti già firmati e timbrati che il re aveva lacerato, e dei quali non doveva rimanere nota né trasferimento, il sovrano dispone come è necessario procedere con i suoi resti mortali, menziona tutti i suoi figli, nomina esecutori testamentari e incarica diverse azioni per la redenzione della propria anima e di quella della prima moglie Isabella. Ricorda i grandi esborsi per la conquista il recupero del regno di Napoli, assegna quantità per la redenzione di prigionieri, la collocazione di orfane in matrimonio e l’elemosina dei poveri, ed enumera le opere costruite per la redenzione della propria anima. Affida ai figli Giovanni e Isabella la verifica dell'adempimento degli ordini, cita la soddisfazione delle doti delle figlie Maria e Catalina, regine consorti di Portogallo e Inghilterra, rispettivamente, i beni e le rendite assegnate alla sposa Germana de Foix e alle regine di Napoli, sorella e nipote, nonché al nipote Ferdinando, perdonando l'altro nipote prigioniero a Xátiva.
Il re muore all'alba del 23 gennaio 1516. Il 24 Germana de Foix scrive ai deputati del Generale della Catalogna per comunicarglielo, firmandosi come “la triste regina”.
Sia nei territori della Corona di Castiglia (incluso il Regno della Navarra, di recente annessione) in cui già governava, che in quelli della corona d'Aragona ( inclusi ultimamente anche il regno di Napoli e le contee del Rosellón e della Cerdaña), le città di Bugia, Algeri e Tripoli nonché i territori delle Indie del Mar Oceano, Ferdinando nomina come erede sua figlia Juana e governatore in suo nome il principe Carlo. Dispose che il testamento servisse da supplemento di età del principe, affinché questi potesse governare. Incaricò agli esecutori testamentari di scrivere ai territori affinché sollecitassero l'arrivo urgente del principe nella penisola dalle Fiandre.
Il testamento e l'immediata morte di Ferdinando II d'Aragona determinano una modifica della mappa dinastica europea, in virtù dell'unione delle due corone ispaniche in un'unica persona, Carlo, che incarnava pertanto la trascendenza di questa dinastia al resto del continente e del mondo conosciuto. Il principe è figlio di Giovanna di Castiglia e Filippo di Borgogna e nipote dei re Isabella e Ferdinando di Castiglia e Aragona e dell'imperatore Massimiliano I e Maria di Borgogna. Si tratta del primo Asburgo di Spagna, futuro imperatore del sacro Romano impero germanico e padre del re nei cui territori non tramontava mai il sole.Salto de línea Salto de línea ACA, Reale Cancelleria, Registri, 3604, ff. 274r-290rSalto de línea ACA, Collezioni, Autografi, I-1-p (b)